动物源性食品中细菌的检测——肉毒梭菌

试剂盒抽提DNA法：取1.4mLTPGY培养物转移至1.5mL离心管中14000g离心2min弃去上清液。菌体沉淀用1.0mL TE缓冲液洗2次后重悬于120μL的25%蔗糖溶液中。加入10mg/mL溶菌酶溶液120μL，混匀，（37±1℃）水浴30min；然后加入20%SDS溶液30μL，轻轻混匀，室温放置5min；再加入10mg/mL蛋白酶K溶液9.0μL，混匀后（37±1）℃水浴30min。悬浮液采用商品化细菌基因组DNA提取试剂盒提取DNA，使用时按照试剂盒说明书进行操作。对提取的DNA进行纯度和浓度测定后置于－20℃保存。

（3）核酸（DNA）纯度和浓度的测定 取适量DNA溶液原液加双蒸水稀释一定倍数后，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测260nm和280nm处的吸光值。DNA的浓度按照式（1）计算。

c＝A260×N×50；    （1）

式中，c为DNA浓度，单位为μg/mL；A260为260nm处的吸光值；N为核酸稀释倍数。

当DNA浓度为0.34～340μg/mL，A260/A280比值在1.7～1.9时，适宜于PCR扩增。

（4）PCR扩增 采用分别针对肉毒梭菌的A、B、E、F型肉毒毒素基因设计的型特异性引物，进行多个PCR扩增，每个PCR反应管检测一种类型的肉毒梭菌。检测时反应体系应设置阳性对照、阴性对照和空白对照。用含有扩增片段的质粒或A、B、E、F型肉毒梭菌的基因组DNA做阳性对照，用非肉毒梭菌基因组DNA做阴性对照，用无菌水做空白对照。

（5）凝胶电泳检测PCR产物 用0.5×TBE缓冲液制备1.2%～1.5%（质量浓度）的琼脂糖凝胶（凝胶加热融化后冷却至60℃左右加入溴化乙锭至0.5μg/mL，或者在电泳后用0.5μg/mL溴化乙锭溶液进行染色），将1.0μL的PCR产物与2.0μL6×加样缓冲液混合，点样，其中一孔加入DNA分子量标准物，以判断PCR产物的片段大小。0.5×TBE电泳缓冲液，10V/cm恒压电泳，电泳时间根据溴酚蓝的移动位置来确定，电泳检测结果用凝胶成像系统记录。

（6）PCR检测结果判定 阴性对照和空白对照均未出现条带，阳性对照出现预期大小的扩增条带，待测样品出现预期大小的扩增条带，判定为PCR检测结果阳性。

4.3.2 核酸探针诊断技术

核酸探针也称DNA探针，特点是特异性好、灵敏度高、检测速度快、一次可检出大量标本，尤其可检查单个菌落的产毒特性，无须专门产毒培养。细菌毒素探针制备通常取自病原菌染色体或质粒毒素基因片段，用于检测毒性相关基因，也可鉴别遗传性状类似的种。

4.4 免疫学诊断

免疫学诊断是目前肉毒毒素检测领域应用最为广泛的检测方法。它可定性定量检测，灵敏度高，特异性好，一次可检测大量标本，能自动化。免疫学诊断检测的一个缺点是必须要有高亲和性抗体，而且该方法不能区分毒素是否具有活性。另外，毒素基因的变异会导致检测抗体与毒素的亲和力降低，出现假阴性结果。目前有以下几种检测方法常被采用。

4.4.1 酶联免疫吸附试验（ELISA）

ELISA是目前使用较为广泛的肉毒毒素检测方法，毒素检测和型别鉴定只需5～6h。尽管抗体来源、酶底物不同，但检测原理基本一致。最常用的是双抗体夹心ELISA法。酶联板上包被检测用单克隆抗体或多克隆抗体，加入可疑样品（待测抗原）后，再加入另一种酶联抗体，待测抗原被带有标记物的二抗捕获后，通过标记物与底物的显色反应来判定结果。美国建立的双抗体夹心ELISA法已经被国家药品监督管理局（SDA）和分析化学家协会（AOAC）批准成为第二个官方认可的检测方法。

4.4.2 胶体金免疫层析法

该技术以胶体金作为示踪标记物，利用抗原抗体的高度专一结合特性及胶体金标记技术的可视定位特性来检测可疑样品。此方法具有如下优点：检测快速，通常可在5～10min出结果；检测试纸条比较稳定，可长期保存；成本相对较低，易于推广；操作简单，操作者无须特殊培训。此技术在毒素检测领域有巨大的发展潜力。

4.4.3 免疫印迹分析

肉毒毒素经电泳转移至硝酸纤维膜上，进行免疫印迹反应；毒素浓度与免疫印迹反应条带密度之间存在良好的线性关系。

首页前一页1234后一页尾页