猪肉中氟苯尼考残留量高效液相色谱-串联质谱检测方法的建立

摘要：本研究通过高效液相色谱-串联质谱法(High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，HPLC-MS/MS)建立了猪肉中氟苯尼考残留物残留量的检测方法，检测限和定量限分别为5 μg/kg和10 μg/kg。在10 μg/kg～4 000 μg/kg浓度范围内，空白猪肉样品的标准曲线线性关系良好，相关系数均在0.99以上。氟苯尼考和氟苯尼考胺的添加浓度在10 μg/kg、500 μg/kg和2 000 μg/kg时，回收率均大于85％，批间和批内变异系数均小于5％。该方法适用于猪可食性组织中氟苯尼考残留量的测定。

氟苯尼考是一种动物专用的半合成酰胺醇类抗生素，有众多的优点，抗菌谱广，动物体内分布广泛，注射或内服均吸收良好，既无潜在致再生障碍性贫血作用，也无致畸、致癌或致突变作用。氟苯尼考能有效治疗由巴氏杆菌和睡眠嗜组织菌引起的牛呼吸道系统疾病，可用于防控猪胸膜肺炎放线杆菌、链球菌和巴氏杆菌引起的猪呼吸道疾病，也可有效治疗鱼类的细菌感染，因此在畜禽养殖中的使用日益频繁。随着氟苯尼考的广泛使用，动物源性食品中氟苯尼考残留问题也引起消费者的担忧，加强氟苯尼考残留监控需建立特异性高、灵敏度好的检测方法。目前，针对氟苯尼考残留量检测方法包括微生物法、酶联免疫吸附法、高效液相色谱法、高效液相色谱-串联质谱法(High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，HPLC-MS/MS)和气相色谱法。其中微生物法的灵敏度和特异性较差，且操作烦琐；酶联免疫吸附法操作简单，但灵敏度较差；高效液相色谱法准确性高，特异性好，但灵敏度同样较差；HPLC-MS/MS准确性高，灵敏度高，特异性好，虽然对仪器设备要求较高，但是极高的灵敏度更适合监控食品中的氟苯尼考残留[1-3]。本研究通过分析比较氟苯尼考检测方法，优化前处理以及色谱条件，建立了一种准确性高、灵敏度高、重复性好的检测猪可食性组织中氟苯尼考残留量的液相色谱-串联质谱法。

1  试验材料

1.1 药品与试剂

氟苯尼考和氟苯尼考胺对照品：含量均为99.5％，购自中国兽医药品监察所。乙腈、甲醇和甲酸为色谱纯，乙酸乙酯、正己烷、氨水、乙酸铵为分析纯。

1.2 仪器设备

液相色谱-三重四极杆质谱联用仪(HPLC-MS/MS)[赛默飞世尔科技(中国)有限公司，型号Thermo Scientific TSQ Endura]。

1.3 标准储备液

氟苯尼考储备液：准确称取10 mg氟苯尼考于50 mL容量瓶，乙腈定溶，配制成200 μg/mL氟苯尼考标准储备液。

氟苯尼考胺储备液：准确称取10 mg氟苯尼考胺于50 mL容量瓶，甲醇定溶，配制成200 μg/mL氟苯尼考标准储备液。

1.4 混合标准工作液

分别量取适量200 μg/mL氟苯尼考和氟苯尼考胺的混合标准储备液，用乙腈稀释，制成5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、200 ng/mL、500 ng/mL、1 000 ng/mL、2 000 ng/mL和4 000 ng/mL的混合标准溶液，现配现用。

1.5 其他溶液配制

3％氨水-乙酸乙酯溶液：准确量取    30 mL氨水，加入970 mL乙酸乙酯混匀即可。

2  方法

2.1 制备试样

取均质后的空白猪肉样品，作为空白试料；取均质后的空白猪肉样品，添加适宜浓度的标准溶液，作为空白添加试料。

2.2 样品处理

准确称取搅碎后的猪肉样品5.00 g (±0.05 g)，装入50 mL聚丙烯离心管中，加入20 mL 3％氨水-乙酸乙酯液，涡旋混匀5 min，在10 ℃下10 000 r/min离心10 min，将上清液转移到另一50 mL聚丙烯离心管中。下层残渣再用20 mL的3％氨水-乙酸乙酯液提取一次，合并以上两次上清液，备用。

移取以上备用液5 mL，50 ℃氮气吹干。残渣用2 mL流动相复溶，加入5 mL正己烷漩涡混匀30 s，然后以5 000 r/min离心10 min，收集下层水相，再用5 mL正己烷重复净化一次，最后用0.22 µm的无机滤膜过滤水相，滤液用(HPLC-MS/MS)检测。

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