时间：2021-07-04 点击： 次 来源：中国兽医发布 作者：曲志娜，赵思俊等 - 小 + 大
| 4.3.5 竞争性酶联免疫吸附试验 竞争性酶联免疫吸附试验可用于测定抗原，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量成反比。操作步骤如下： （1）用特异性抗原包被96孔酶标板，于4℃温孵18h，可直接使用，也可于－20℃冻存，用前于37℃30～45min解冻。 （2）用PBST洗涤微量板4次以去除未吸附的抗原。 （3）第一列双孔首先加稀释的单克隆抗体50μL，之后立即再加入1∶10稀释的强阳性、弱阳性、阴性对照血清和1×样品稀释液50μL作为平行对照，从第二列起每孔加稀释的单克隆抗体（M84）50μL，立即再加上1∶10稀释的被检血清50μL。室温（18～28℃）下孵育30min。 （4）用PBST洗涤微量板4次以除去其他未结合的血清，在干净的吸水纸巾上拍打除去残留的洗涤液；然后每孔加入l00μL的PBST稀释酶标抗体，室温（18～28℃）下孵育30min。 （5）洗涤4次除去其他未结合的物质，在干净的吸水纸巾上拍打除去残留的洗涤液；然后每孔加入100μL稀释好的底物或显色剂，室温（18～28℃）下孵育2min（前30s需轻轻地振动96孔微量板）。 （6）再加入100μL的终止液阻止酶继续反应，轻轻振动96孔微量板30s，在酶标仪450nm波长下读取OD值。 抑制百分率（I）＝100－被检样品OD值/强阳性对照平均OD值 I大于40%即认为被检样品为阳性。 4.4 分子生物学检测方法 4.4.1 荧光探针分析法 荧光探针分析法是可以在实验室外快速准确地进行布鲁氏菌诊断的方法。其机制可能与溶液中分子的随机旋转有关，分子的大小与旋转速度成相反关系。对于大多数荧光探针分析法来说，用荧光标记分子量低于50ku的抗原（布鲁氏菌的抗原大约在22ku），然后加进血清或其他的液体中，以检测抗体。如果存在抗体，抗体和标记的抗原结合，导致其旋转速率减慢并可以测量减慢的速率。 4.4.2 PCR检测技术 根据GenBank上公布的不同类型布鲁氏菌基因序列中的保守片段，应用Premier5.0软件设计和合成特异性引物。对待检样品进行处理，抽提DNA，制备DNA模板；按照常规PCR进行扩增，得到扩增序列后测序，与公布的序列进行同源性比对。
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