动物源性食品中细菌的检测——布鲁氏菌

4 检测方法

4.1 染色检查

疑似布鲁氏菌病的病料以绒毛叶渗出液、胎儿的胃内容物、肺脏、脾脏、阴道分泌物或脓肿中的脓汁以及培养物制成抹片。除用革兰氏染色法染色外，还可以应用鉴别染色法进行染色。

4.1.1 改良Ziehl-Neelsen氏法

适用于做胎膜和流产胎儿内容物染色。流产数日内取阴道拭子制作抹片，也可用此法染色。具体步骤是：

（1）抹片晾干，在火焰上固定。

（2）用ZiehlＧNeelsen氏石炭酸复红原液的1∶10稀释液染10～15min（原液为碱性复红1g，溶于10mL无水乙醇中，加入5%石炭酸溶液90mL）。

（3）水洗后，用0.5%乙酸脱色15～30s。

（4）充分水洗后，用1%美蓝复染20～60s。

（5）水洗、干燥、镜检。

镜检结果：布鲁氏菌被染成红色，背景为蓝色。

4.1.2 改良Koster氏法

（1）抹片自然干燥，用火焰固定。

（2）用新配制的番红和氢氧化钾混合液（番红饱和水溶液2份与1mol/L氢氧化钾5份混合）染1min。

（3）水洗后，用0.1%硫酸脱色10s（或在10～20s用0.1%硫酸处理两次）。

（4）水洗后，用1%美蓝复染3s。

镜检结果：布鲁氏菌呈橘红色，背景为蓝色。

4.2 分离培养鉴定

4.2.1 分离培养

布鲁氏菌在体内分布广泛，几乎从病畜的所有组织器官、血液、乳汁及流产病料（胎儿的胃内容物、肝、肺、脾、羊膜液、胎盘及阴道排出物）中均能分离到细菌。采集无杂菌感染的病料样品各两份，分别接种胰蛋白胨培养基培养；或者如果是有杂菌污染的病料样品，可用加有杆菌肽、放线菌酮、乙种多黏菌素的选择性培养基。一份在37℃温箱中需氧培养；另一份在37℃含5%～10%二氧化碳烛缸中培养，分别在第2、3、4、5天进行观察，以后每隔3～4d观察一次，共3周。若在37℃温箱中需氧连续培养未有细菌生长，在二氧化碳烛缸中培养长出淡蓝色、圆形、稍隆起、透明、细小、表面光滑、均质的革兰氏阴性球杆菌，用鉴别染色法进行染色，细菌被染为红色且菌形为球杆或短杆状，则进一步进行生化鉴定。

4.2.2 生化鉴定

（1）石蕊牛乳试验 将培养纯化后的细菌接种于石蕊牛乳培养基中，培养观察1周，石蕊牛乳培养基变成蓝色者为阳性反应，不变色者为阴性反应。

（2）甲基红试验 接种纯化的细菌于葡萄糖蛋白胨水培养基中，37℃培养3d后，加入甲基红试剂，观察颜色变化。呈红色者为甲基红试验阳性反应，呈黄色者为甲基红试验阴性反应。

（3）VP试验 将细菌接种于该培养液中，37℃培养3d后，依次加入6%α萘酚酒精溶液0.6mL和40%氢氧化钾水溶液0.2mL，充分振荡，观察结果。在数分钟内出现红色者为维培二氏试验阳性，颜色不变为维培二氏试验阴性。

（4）枸橼酸盐利用试验 在枸橼酸盐细菌鉴定管中接种细菌，24～48h后观察培养基颜色变化和菌落生长情况。如果有菌落生长，培养基从绿色转变为蓝色，则为阳性；阴性则不见有细菌生长，培养基仍为绿色。

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