鸡传染性支气管炎诊断方法的研究进展

3 分子生物学诊断方法

近年来，随着分子生物学检测手段的不断发展和完善，该方法已成为鸡传染性支气管炎病毒检测中使用最多的工具。这类方法的灵敏度高、反应时间快，不仅能用于病毒的快速检测，还可以从遗传角度对检测到的毒株特征进行描述，从而可以合理地制定疫苗接种方案。目前，很多分子生物学的诊断方法都是基于反转录聚合酶链式反应（RT-PCR），这些方法有的是针对几乎所有鸡传染性支气管炎病毒亚型的通用方法，有的则是针对其基因型或毒株的特异性方法。采用RT-PCR方法可对样本中存在的病毒进行定量，这有助于判断疾病是否主要由鸡传染性支气管炎病毒引起，而且定量检测疫苗毒株滴度还可用于评估疫苗接种效果和持久性。赵秀美等通过设计针对鸡传染性支气管炎病毒株5′端非编码区保守区域序列的特异性引物，建立了一种能够快速定量检测该病原且具备良好特异性和重复性的RT-PCR方法。鸡传染性支气管炎病毒的遗传变异主要集中于病毒的S1基因，因此该基因也成为PCR方法最常用的靶向区域。陈淑琴等根据不同基因型的鸡传染性支气管炎病毒S1基因序列差异较大的区域设计特异性引物和探针后建立的RT-PCR检测方法，能够快速鉴别GVI-1基因型毒株与其他基因型毒株。当存在多个毒株同时感染的情况时，通用的RT-PCR和Sanger测序只能检测到具有最高滴度的一个毒株。而不同引物的特异性不同也可能引起检测结果的偏差，因此不同的检测方法检测到不同的毒株是很常见的。在实际生产中，应该针对养殖地区流行的毒株来选择通用或特异性的RT-PCR检测方法。

限制性酶切片段长度多态性分析是一种通过病毒基因限制性酶切图谱进行分型的方法。该方法结合了RT-PCR技术，主要原理是提取编码病毒抗原表位基因，采用RT-PCR扩增DNA片段，随后用限制性内切酶进行处理，根据酶切图谱进行病毒分型。Kwon等采用RT-PCR技术扩增出含S1基因、长度为1 720 bp的传染性支气管炎病毒基因序列，随后进行纯化及限制性内切酶处理检测，发现检测结果与中和试验得出的病毒血清分型一致，表明限制性酶切片段长度多态性分析技术可用作鸡传染性支气管炎病毒诊断。但值得注意的是，鸡传染性支气管炎病毒会不断发生变异和进化，因此需要定期更新所用的限制性内切酶。

近年来，其他的分子生物学诊断技术，如环介导等温扩增技术（LAMP）、核酸探针技术和基因芯片技术等也已被用于鸡传染性支气管炎病毒的检测。Wu等将RT-LAMP与横向流动试纸（LFD）相结合，建立了一种能同时检测鸡传染性支气管炎病毒和新城疫病毒的新型检测方法。赵玉佳等构建了联合检测鸡传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒和新城疫病毒的基因芯片，并对芯片的敏感性、特异性及稳定性进行了评价，结果显示该检测技术能够用于临床病料中上述三种病原的检测和快速诊断。此外，下一代测序技术最近也被用于研究，尽管目前这种方法对于常规使用来说过于昂贵和费力，但也可实现特定的检测目的。

4 小结

传染性支气管炎严重影响到鸡的健康生长，为了降低该病的发生率，需做好日常监测和预防，而对该病的准确诊断是有效开展防控的基本保障，具有十分重要的意义。目前，该病的诊断方法除了上述提到的病毒分离鉴定、血清学诊断和分子生物学诊断三种主要方法外，免疫组织化学技术和蛋白芯片技术等也得到了探索和应用。但无论哪种方法都有各自的优势和缺点，单一一种方法在目前都还难以完全满足检测所要求的快速、灵敏、特异、简便、经济和实用等。因此，在实际检测时应该根据需要，结合拥有的实验条件和操作经验，选择最适宜的检测方法或将不同的方法结合起来应用，以便能够获得最好的效果。

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