动物源性食品中细菌的检测——分枝杆菌属

4.2 分离培养

为了排除分枝杆菌以外的微生物，将上述离心沉淀物用5mL灭菌生理盐水重悬沉淀，取1份悬液加2份草酸或5%氢氧化钠混合，室温放置5～10min，上清液小心倒入装有小玻璃珠带螺旋帽的小瓶或小管内，37℃放置15min，3000～4000g离心10min，弃去上清液，用无菌生理盐水洗涤沉淀，再次离心。取少许沉淀物接种在培养基斜面上，每份病料接4～6管，管口封严，置37℃培养，每2～3d观察一次，2周以后每周观察一次，至8周后无菌落生长即可报告为阴性。常用的培养基有罗杰二氏（Lowenstein-Jensen）培养基（内含蛋黄、甘油、马铃薯、无机盐及孔雀绿等）、改良罗杰二氏培养基、丙酮酸培养基和小川培养基。培养阳性时，需进行培养特性和生化特性鉴定。

分枝杆菌在添加特殊营养物质的培养基上才能生长，但生长缓慢，特别是初代培养，一般需10～30d才能看到菌落。菌落粗糙、隆起、不透明、边缘不整齐，呈颗粒、结节或花菜状，乳白色或米黄色。在液体培养基中，菌体因含类脂而具疏水性，形成浮于液面有皱褶的菌膜。

结核分枝杆菌可合成烟酸和还原硝酸盐，牛分枝杆菌无此特性；结核分枝杆菌和牛分枝杆菌触酶试验阳性，但耐热触酶试验阴性；而禽分枝杆菌两种试验均为阳性。各型分枝杆菌均不发酵糖类。

4.3 动物接种

以30mL鲜乳样品离心（3000r/min）15min，然后先收集上层乳脂，再收集数毫升底部的乳样及其沉渣混合物。取这些混合物3mL，按照300～350g/只的剂量，鼠蹊部皮下注射健康豚鼠2只。再取上层乳脂，用少许无菌水稀释，按照上述同样剂量，鼠蹊部皮下注射豚鼠2只。3～4周后，如果注入的材料中含结核分枝杆菌数量较多，可见接种部位附近淋巴结肿大，试验豚鼠采食量减少，体重减轻，不久死亡；如果注入的菌数不多，则症状常不显著，如果8周以上仍未死亡，将豚鼠杀死剖检。为及早得到结果，也可以在注射3～4周后，对试验豚鼠进行结核菌素试验。先将豚鼠腹部的毛剃掉，然后皮内接种结核菌素0.1mL。阳性者在24～28h后在接种部位出现红肿硬块，表明已经感染，可进行剖检。

剖检可见在接种部位附近的淋巴结肿大，淋巴结内部充满干酪样物，脾、肝等处常有无数微小的结核病变，取淋巴结内的干酪样物或者病变部位的结节抹片染色镜检，可有结核分枝杆菌检出。

4.4 变态反应

采用结核菌素试验（国际贸易指定试验）。结核菌素试验是测定牛结核病的标准方法，即皮内注射牛结核菌素纯化蛋白衍生物（PPD），并在3d后测量注射部位肿胀的程度。一般在颈的中部进行，但在特殊情况下，可在尾根处进行。对于结核菌素，颈部皮肤要比尾根处更敏感。

结核菌素效力必须用生物学方法测定，将这种方法与标准结核菌素比较作为依据，并用国际单位（IU）来表示。在许多国家，牛结核菌素保证每头牛剂量达2000IU（±25%），方可被认为效力可靠。对于过敏性较差的牛，需要用高剂量的牛结核菌素，在扑灭牛结核病运动中，则推荐使用剂量为5000IU，每次注射量不超过0.2mL。

皮内注射对比试验，注射的结核菌素量不应少于2000IU。两次注射的位置间隔为12～15cm。

幼龄动物颈部一侧没有足够的地方分开注射，故在颈部不同侧面注射，而且注射均在颈中1/3相对应的部位。

结核菌素试验的操作程序：

（1）注射技术必须正确，注射部位必须剪毛和消毒。剪毛区的皮皱厚度用卡尺测量。用一短针头且斜边向外装有结核菌素的刻度注射器，倾斜插入皮内深处，然后注入结核菌素。注射正确的话，在注射部位可摸到像豌豆大小的肿胀。注射后72h，测量每一个注射部位皮皱的厚度。注射前和试验结果测量应由同一个人完成。

（2）结果解释判定 单项皮内注射试验（只注射牛结核菌素），如果只观察到局限性肿胀，增厚不超过2mm，而且没有临床症状，例如扩散或延展性水肿、渗出、坏死、该区内淋巴管或淋巴结的疼痛或发炎，就可认定反应为阴性。如果有上述临床症状，或者皮皱厚度增加超过2mm而小于4mm，可认为反应为阳性。此外，在牛分枝杆菌感染群中，有任何明显的、可见的肿胀都认为是阳性。有时需要更加严格的判定，尤其在高度危险群或接触的动物。对单项皮内注射试验未得出结果的动物，应在间隔42d后另外进行试验。第二次试验结果不是阴性的动物应视为阳性。皮内注射试验阳性的动物可做皮内注射对照试验。

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