动物源性食品中寄生虫的检测——新孢子虫

4.1 病原学检测

4.1.1 病原的分离与培养

采集新鲜死胎的脑组织，在含青霉素和链霉素的PBS溶液中无菌匀浆，19～25号针头过滤，加入胰蛋白酶消化，离心，最后沉淀悬浮于含有2%马血清、青霉素和链霉素的RPMI-1640中，取0.5mL悬浮液接种于单层Vero细胞中，37℃培养观察。Yamane等将犊牛组织接种于牛心肺主动脉内皮细胞和猴肾细胞中培养，接种后49d观察到新孢子虫速殖子。直接分离可见的虫体并不容易成功，可先将病料组织皮下接种小鼠、大鼠、沙鼠、犬、猫、家兔等，发病后采集中枢神经或内脏组织进行特异性检验，可提高检出率。

4.1.2 免疫组织化学检测

采集病死动物的大脑、脊髓、肝、肾、胎盘或其他病变部位，用兔抗新孢子虫血清对经福尔马林固定、石蜡包埋的组织切片染色，可以检测到新孢子虫速殖子和缓殖子，并且这种方法与刚地弓形虫及其他球虫目的病原体无交叉反应，但不够敏感，尤其是胎儿组织自溶时，这种方法不能做出准确诊断。

4.1.3 病理组织学检查

采集动物流产胎儿的脑、脊髓、心脏及肝等组织进行常规组织学检查。神经系统病变以非化脓性脑脊髓炎为主要特征，并且病灶周围有单核细胞浸润。心脏多表现为多灶性心肌炎和多灶性心内膜炎。肝脏表现为坏死性肝炎，有大量浆细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和少量中性粒细胞浸润。肝门静脉周围单核细胞浸润，出现不同程度的坏死灶及纤维蛋白血栓。但要确诊必须检测到新孢子虫速殖子或组织包囊。

4.2 血清学检测

有多种血清学方法用于检测新孢子虫抗体，其中IFAT和ELISA应用广泛，且检测结果的特异性和敏感性都较高。但ELISA与IFAT比较，其优越性表现在操作规范化，不受主观因素的影响，同时更适用于大批量样本的检测，例如进行血清学调查。

4.2.1 直接凝集试验（DAT）

经福尔马林固定的完整速殖子在特异性抗体的作用下发生凝集，用于检测IgG和IgM抗体。Packham等用新孢子虫DAT和IFAT两种检测方法对16种不同种属动物的血清进行检测，认为DAT较IFAT有一定的灵敏度和特异性。DAT不需要特定的设备和种属特异性的二抗就可以对大量血清样品进行流行病学调查，但是对新孢子虫诊断抗原制备要求比较高，要保证速殖子的完整性。

4.2.2 ELISA

ELISA具有较高的特异性、敏感性和稳定性，操作简便，方法类别多且易于掌握，适用于临床病例的诊断和流行病学调查。新孢子虫病ELISA主要建立在整体或部分纯化的自然的新孢子虫抗原、重组的新孢子虫抗原、新孢子虫抗体活性以及新孢子虫特异性竞争抑制性单克隆抗体的基础上。

天然抗原ELISA：速殖子通过反复冻融后超声裂解，再经离心提取水溶性成分作为包被抗原，包被在酶标板上，加入待检血清，再滴加酶标记的二抗（如辣根过氧化物酶标记的抗绵羊IgG），利用酶的催化作用和底物放大反应原理，对待检抗体进行定性和定量分析。Pare等于1995年首次将ELISA用于牛的新孢子虫抗体的检测，利用牛速殖子裂解物作为抗原建立的ELISA的灵敏度和特异性分别为89%和97%。

重组抗原ELISA：将新孢子虫致密颗粒蛋白、膜表面蛋白基因克隆，通过与谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）一起作为融合蛋白而使之在大肠杆菌中表达。将纯化的重组蛋白作为抗原包被酶标板，用于检测新孢子虫抗体。目前已经报道了关于致密颗粒蛋白和膜表面蛋白等重组蛋白的ELISA。Chahan等用新孢子虫表面蛋白1（NcSAG1）建立ELISA，与弓形虫感染的血清没有交叉反应。Lally等分别应用30ku和35ku的新孢子虫致密颗粒蛋白6和致密颗粒蛋白7（NcGRA6和NcGRA7）的两种重组蛋白为抗原建立了ELISA，急性感染牛的血清经这两种方法检测与IFAT有很好的一致性。刘晶等利用新孢子虫体外重组表面蛋白dNcSRS2蛋白作为包被抗原，建立检测新孢子虫血清抗体的间接ELISA，试验结果证明该方法的重复性好、特异性强、灵敏度高，与IFAT和ELISA试剂盒的符合率均达到92%以上。

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