非洲猪瘟病毒在野猪尸体内的存活研究

时间：2021-10-02    点击： 次    来源：中国动卫中心    作者：佚名 - 小 + 大

2.2.2 基因组检测 在立陶宛国家参考实验室，使用QIAamp®RNA微型病毒试剂盒(Qiagen)提取非洲猪瘟病毒核酸。根据King 等人(2003)的方案，用qPCR对所有样品进行非洲猪瘟病毒基因组筛查。在德国弗里德里希-莱弗勒研究所，使用DNeasy®PowerSoil®病毒试剂盒(Qiagen)提取土壤和腐烂基质样品的核酸。采用qPCR方法 (Tignon 等人, 2011)对获得的样品进行非洲猪瘟病毒基因组筛选，beta-actin基因用于内对照。此外，对土壤样品进行猪细胞色素B基因筛选(Forth, 2015)，以检测是否存在野猪DNA。 2.2.3 病毒分离 为检测传染性非洲猪瘟病毒，将均质骨髓和组织样品直接加入均质液，盲传3代后检测外周血单核巨噬细胞(PBMC)上的血细胞吸附。 用于制备外周血单核巨噬细胞的血液取自健康的家养猪。简而言之，利用Pancoll动物密度梯度培养基(PAN Biotech)从edta抗凝血中获得外周血单核巨噬细胞。外周血单核巨噬细胞在含有4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸(HEPES)和10%胎牛血清(FCS)的37℃的含5% CO2的湿化无血清细胞冻存(RPMI)-1640培养液中生长。培养液中加入两性霉素B、链霉素和青霉素，以避免细菌和真菌的生长。为促进巨噬细胞成熟，在2ng/ml浓度的细胞培养液中加入Biomol公司生产的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。为实现盲传，在t12.5细胞培养瓶(Corning™)中，将1ml的匀浆添加到外周血单个细胞来源巨噬细胞(1 × 107个细胞/ml)中。培养48-72小时后，将细胞培养冷冻瓶解冻，进一步传代和检测。 血细胞吸附试验(HAT)按照稍作修改的标准程序进行(Carrascosa, Bustos,& Leon, 2011)。简单地说，将分离出的每孔100 μl外周血单个细胞以5×106个细胞/ml的密度接种到96孔微孔板(Corning™Primaria™)中。16-24小时后，去除非黏附细胞，按上述方法补充含有GM-CSF的细胞培养液。然后将培养物孵育24小时，使巨噬细胞初始成熟。之后，每孔加入匀浆上清液30µl。从盲传样品中，每孔加入100µl细胞培养上清液。样品进行8个重复试验。孵育24小时后，每孔加入20µl的同源1%红细胞悬液。为读取数据，在3天的时间内检查培养物的血细胞吸附情况。当直接使用骨髓或组织匀浆时，在37°C下用温热磷酸缓冲盐溶液(PBS)吸附2小时后清洗细胞，细胞培养上清液则留在细胞上，直到检测得到最终评估。采用亚美尼亚2007非洲猪瘟病种毒作为阳性对照。可疑结果通过额外传代和细胞上清液qPCR检测(King 等人,2003)得到证实。 为排除非血细胞吸附非洲猪瘟病毒株的存在，根据Carrascosa 等人(2011)发表的方案，对每个尸体样品进行间接免疫荧光染色筛选。简而言之，福尔马林固定巨噬细胞与抗病毒蛋白p30的单克隆抗体(由英国 Pirbright研究所Linda Dixon提供)一同培育，然后用市售荧光抗体山羊抗小鼠IgG (H + L)，Alexa Fluor®488 (Thermo Fisher)染色。 德国主管部门(Landesamt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei (LALLF) Mecklenburg-Vorpommern)批准通过采集猪血用于德国弗里德里希-莱弗勒研究所的调查研究工作(参见文件编号LALLF 7221.3-2-041/17)。在本研究中没有进行其它动物实验。使用Microsoft Excel 2007 (Microsoft)和SigmaPlot for Windows version 11.0 (Systat software, Inc.)软件工具对数据进行分析。 图1 尸体状况评分示例图片。评分①皮肤封闭，器官完整;评分②残余组织;评分③只见骨头 首页前一页12345后一页尾页