口蹄疫免疫抗体检测经典方法详述

国际粮农组织（FAO）、世界动物卫生组织（WOAH）和我国农业农村部发布的《国家动物疫病监测与流行病学调查计划（2021-2025）》，推荐用口蹄疫抗体液相阻断ELISA检测方法对口蹄疫免疫效果进行评价。

一、液相阻断ELISA实验原理

液相阻断ELISA 实验原理是抗原抗体在液相中反应，病毒抗原与稀释好的被检血清首先在液相中反应，然后抗原抗体复合物和没有完全被血清抗体阻断的病毒抗原被转移到包被了口蹄疫特异性抗体的ELISA板中，没有完全被血清抗体阻断的病毒抗原被ELISA板中的抗体捕获，再通过酶结合物与底物显色10～15 min，最后加入终止液进行读数。抗体滴度以阻断50%病毒抗原的血清稀释度表示。

二、液相阻断ELISA特点

1、优势

口蹄疫抗体液相阻断ELISA检测方法专为检测FMD全病毒抗体设计，是针对完整病毒粒子的抗原位点进行抗体定性定量检测，通过对被检血清的倍比稀释，定量测定血清中抗体含量的高低。液相阻断ELISA与中和试验的原理相似，又被称为体外病毒中和试验，克服了病毒中和试验无法在临床检测中推广应用的缺点，适用于大批量样品的血清学调查。同时，口蹄疫液相阻断ELISA抗体检测技术具有良好的敏感性、可重复性，与攻毒保护有很好的相关性，现被广泛应用于口蹄疫免疫抗体水平的监测。

2、劣势

液相阻断ELISA操作步骤较多，耗时较长，对实验检测人员技术性、熟练性和操作性要求较高。

三、液相阻断ELISA的操作细节及注意事项

1、样品的保存及使用

全血样品采集后应尽快分离血清避免溶血，500～4000 rpm 离心 5～10 min；若无离心条件，可将全血样品在室温下(20℃)倾斜放置2~4小时(依室温而定)，或4~8 ℃环境中过夜待其自然凝固，然后转移上清液于新管待测。血清 0～4 ℃条件下可保存5 d，如采用 －15～－20℃ 冷冻保存时间更长。冷冻保存血清样品需在4～8 ℃条件下解冻，再平衡至室温，稀释前需充分混匀。

2、试剂的回温及孵育

（1）试剂回温

试剂盒中的试剂，包括包被用的反应板，在使用前应恢复至室温，将其提前拿出放置1～2 h平衡至室温（20～25℃），冬季可置于 25℃左右的恒温培养箱内回温。

（2）加样孵育

每次加样后反应板必须用封板膜封严，否则会造成水分过多蒸发，影响实验结果；反应板尽量均匀放置于孵育箱，不可重叠放置，以免传热不均匀。在孵育时，实验操作者一般习惯将ELISA板放入温箱即开始计时，没有考虑ELISA板孔内温度升至37℃尚需一定的时间，这样容易造成实际测定中温育时间不够，因此实验时需根据具体室温情况可适当增加ELISA板在温箱中的孵育时间。

3、不同批次试剂盒的使用

不同批次试剂盒中的每种试剂成分都被优化和作为一个整体工作，为了使实验结果准确，避免使用不同批次的试剂成分，尤其是病毒抗原，不同批病毒抗原的工作浓度不同，因此不能随意乱用，要对应于相同批次试剂盒中的各种成分使用，同时要避免反复冻融病毒抗原，可将其先进行小体积封装-20 ℃保存（-40 ℃保存效果更好），每次实验时按需取封装抗原。

4、试剂的配制

配制试剂前后都要充分混匀，浓缩的PBST液在低温下会有无机盐结晶析出，使用前可水浴或恒温培养箱融化，用无离子水或超纯水做25 倍稀释。底物溶液按操作说明配制，现配现用。

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