5.1 核酸探针诊断 为了克服血清学方法诊断的缺点，Stemke将猪肺炎支原体DNA的EcoR酶切片段随机克隆f～M13mpl9中，并用重组产物制成探针，可检测到约10pg的猪肺炎支原体DNA，但该探针不能检出猪气喘病肺中的肺炎支原体DNA，只有将病原培养增殖后方可检出。Ahrens等(1991)将猪肺炎支原体基因文库中的1个l.3 kb的DNA片段通过点杂交后检测猪、牛的不同支原体，结果仅对猪肺炎支原体有特异性反应，以35s标记作探针可检出100pg的猪肺炎支原体DNA。Abiven等(1992)应用pBR322质粒Hind III染色体片段构建了猪肺炎支原体的部分基因组文库，并研制出了相应的探钊，用32P标记后可检测出400pg的猪肺炎支原体DNA。核酸探针法比分离培养法快得多，比血清学方法更可靠，并可用于早期感染。 5.2 聚合酶链式反应(PCR) 随着对猪肺炎霉形体分子生物学研究的深人以及对16s rRNA和23s rRNA的了解，人们开始设计合成与16s rRNA基因或其他基因序列特异结合的引物来检测猪肺炎霉形体。 5.2.1 普通PCR技术：Harasawa等(1991)报道合成针对猪肺炎霉形体的引物，可扩增520bp的DNA片段，产物以合成的寡核苷酸探针进行印迹杂交鉴定，证明这种方法具有特异性。Areiushin等(1993)根据16s rRNA 序列设计PCR引物，通过种特异性寡核苷酸探针进行鉴定，能够扩增出人工感染猪气管分泌液和肺病灶样品中的猪肺炎霉形体，并且所建立的PCR 方法具有较强的特异性和敏感性。Stemke等(1994)建立的PCR可用于猪肺炎霉形体的检定与猪鼻霉形体、絮状霉形体的鉴别，引物选自l6s rRNA基因序列，以猪肺炎霉形体和絮状霉形体DNA扩增，可获得大小为200bp和400bp的产物，而猪鼻霉形体未有扩增产物。Blanchard等(1996)将PCR的敏感洼极限提高到500fg的提纯猪肺炎霉形体DNA(约4×10菌数)，以此检查试验感染猪气管、支气管冲洗液，结果与免疫荧光对照的符合率达到84.6%(121/l43)。Sorensen等(1997)将200头SPF猪感染猪肺炎霉形体强毒而使其人工发病,产生临床症状，证明在猪发生肺炎的急性期，PCR方法具有高度敏感性，优于分离培养、免疫荧光检测和ELISA方法。Caron等(2000)通过扩增猪肺炎霉形体的P36和P46蛋白基因，可以区分猪肺炎霉形体和猪鼻霉形体感染。在国内，于敏等（2003)根据国内外发表猪肺炎霉形体16s rRNA基因设计了一对特异性引物，扩增出一个大小为653bp的特异性片段，敏感性试验显示这对引物能够检测到lng的DNA，结果表明此方法特异、敏感。Zech(2005)发展了一种real-time PCR(rtPCR)方法，从活猪鼻拭子中检测猪肺炎支原体，检测了730份不同猪场的鼻拭子，结果显示该方法快速、准确，有100%特异性。Stakenborg等(2006)发展了一种多重PCR方法，可以从临床肺组织中快速鉴别猪肺炎支原体、猪鼻支原体和絮状支原体。 5.2.2 套式PCR技术：Stemke等(1997)发展了套式PCR技术,敏感性提高到可检测出一个MhpDNA，并可以直接特异性地检测出肺中的Mhp。Stark等(1998)用新的套式PCR首次成功地在试验条件和野外条件下检测出空气样品中的Mhp。Calsmiglia等(1999)根据猪肺炎霉形体的l6s rDNA设计了两套种特异性套式PCR引物，研究了一组猪鼻拭子标本中的猪肺炎霉彤体DNA，发现PCR的检测阳性率为3.6%(2/55),而套式PCR的检测阳性率为54.5%(30/55),实验得到了预期的结果，且与存在于猪呼吸道的其他种霉形体无交叉反应，说明该检测方法对从鼻拭子中检测猪肺炎毒形体优于其他PCR法。Verdin等(200)报道,应用套式PCR检测猪气管，支气管灌洗液中的猪肺炎霉形体DNA较ELISA和IF法更为灵敏。Vicca等(2002)调查了临床感染猪肺炎霉形体和亚临床感染猪肺炎霉形体的猪群，用套式PCR研究鼻拭子中的猪肺炎霉形体，发现第6周时阳性猪存临床和亚临床感染猪群中的百分率分别为16%和0。同年，Kurth等(2002)应用套式PCR检测了一些来内试验感染猪肺炎霉形体的猪样品，结果表明来自支气管小泡和气管支气管位点的样品是大多数感染猪肺炎霉形体的前兆，而鼻拭子和肺组织位点的样品不是实验引发感染的可靠指标。Otagiri等(2005)发展的套式PCR通过检测鼻拭子可以用于猪支原体肺炎的监测。随机引物PCR可试用于强弱毒株的区分，基因缺失变异的检查是另一种手段。Blandchard(1996)发现一种ATP结合转运蛋白(ABC)基因，它存在于所有的Mhp野毒株中，而一些传代的J株则缺失此基因，这对强弱毒株的区分有不同寻常的作用。 6 猪支原体肺炎疫苗研究现状 6.l 弱毒疫苗 至今所使用的猪肺炎支原体疫茁大多是灭活疫苗，免疫效果均不理想，保护率低。中国兽医药品监察所研制成的猪喘气病乳兔化弱毒冻干苗，经使用表明该疫苗安全有效，能使80%的免疫猪在强毒攻击后肺组织不出现任何病变，而对照组全部发病，是世界上首先成功研究出的猪喘气病弱毒疫苗，而且其保护率至今仍是最高的。但该疫苗也存在一定的缺陷，即产量低、成本高、反应较大，此外采用胸腔注射的免疫途径不容易被一般用户所接受，因而在推广应用上受到限制。江苏省农科院畜牧兽医研究所研制的168株弱毒菌苗，对杂交猪安全，但对地方猪仍不够安全。 6.2 基因工程疫苗 由于使用传统的制苗方法生产Mhp疫苗中遇到了困难，人们便希望借助生物工程的方法，通过大量表达Mhp主要抗原蛋白来生产有效的猪喘气病疫苗。由于Mhp和大多数支原体一样存在密码子与通用密码子的差异问题，使得Mnp抗原蛋白在其它生物中的表达变得困难，尽管如此仍有部分研究获得了成功。
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